Сюжет Resident Evil 5 розгортається в Африці, у вигаданому районі Кіжуджу (Kijuju). Після падіння корпорації "Амбрелла" виробництво біологічної зброї не припиняється, а швидше навпаки, набирає обертів. Для боротьби з біотероризмом був створений загін спеціального призначення BSAA (Bioterrorism Security Assessment Service), у якому складаються головні герої гри — Кріс Редфілд (герой Resident Evil, Resident Evil Code: Veronica та Resident Evil: Umbrella Chronicles) та його партнер із місії Шева Аломар. Корпорація TriCell, заснована на руїнах Амбрели Альбертом Векером, є одним із найбільших представників на ринку фармацевтичних продуктів (а також біоорганічної зброї, яка розробляється під цим прикриттям). План Вескера полягає в тому, щоб випустити смертельний вірус за допомогою виверження вулкана.

Продюсер гри Дзюн Такеуті, заявив, що геймплей RE5 такий самий, як і RE4. Гравець керуватиме персонажем Редфілда через плече. Так само в грі з'являться нові доповнення, роблячи гру по-справжньому реалістичною. Наприклад, якщо Кріс буде занадто довго перебувати на сонці, він почне бачити світжі та шульфи. Також у грі реалізовані різні світлові ефекти. Наприклад, якщо гравець був тривалий час у темному або світлому приміщенні та переходить з однієї зони в іншу, то втрачає зір на короткий проміжок часу, поки очі персонажа не адаптуються.