Сюжет Resident Evil 5 разворачивается в Африке, в вымышленном районе Кижуджу (Kijuju). После падения корпорации "Амбрелла" производство биологического оружия не прекращается, а скорее наоборот, набирает обороты. Для борьбы с биотерроризмом был создан отряд специального назначения BSAA (Bioterrorism Security Assessment Service), в котором состоят главные герои игры - Крис Редфилд (герой Resident Evil, Resident Evil Code: Veronica и Resident Evil: Umbrella Chronicles) и его партнёр по миссии Шева Аломар. Корпорация TriCell, основанная на руинах Амбреллы Альбертом Вескером, является одним из крупнейших представителей на рынке фармацевтических продуктов (а также био-органического оружия, которое разрабатывается под этим прикрытием). План Вескера состоит в том, чтобы выпустить смертельный вирус при помощи извержения вулкана.

Продюсер игры Дзюн Такэути, заявил, что геймплей RE5 такой же как и RE4. Игрок будет управлять персонажем Редфилда из-за плеча. Так же в игре появятся новые дополнения делая игру по-настоящему реалистичной. Например, если Крис будет слишком долго находиться на солнце, он начнет видеть миражи и галлюцинации. Так же, в игре реализованы различные световые эффекты. Например, если игрок находился продолжительное время в темном или светлом помещении и переходит из одной области в другую, то он теряет зрение на короткий промежуток времени, пока глаза персонажа не адаптируются.